随着可用于SPE的材料种类的增加及方便的小型器械的商品化，SPE在小分子及多肽类物质的研究中广泛使用L1引。SPE的原理与柱层析类似，主要包含离子交换和反相色谱机制，洗涤和洗脱可用盐溶液，水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合液，也可用环己烷等非极性溶剂洗涤，从而有效去除疏水杂质。Ji等开发了半自动的96孔板SPE提取流程，实现了对相对分子质量为10 464的蛋白质分子的血浆样品提取，且满足临床前研究的要求。文中还指出96孔板SPE形式的主要优势在于使用圆盘替代层析柱，减少了样品的洗脱体积；与自动化液相处理系统保持了良好的兼容性，从而大大提高了样品制备的通量。自动化的SPE方法结合柱切换技术，使单位临床样本的分析时间小于10 min，并且保持了粗分离和低变异。由于肽类分子的物理化学性质介于小分子有机物和大分子蛋白质之间，需充分考虑肽类分子和生物基质的理化性质以选择适当的制备途径。同时，实验台限于目前质谱技术发展的阶段，生物技术药物分析中应用最多的还是相对分子质量较小的多肽类药物。表1总结了近年应用LC．MS联用技术定量分析蛋白质、多肽类药物的部分具有代表性的研究实例。 以下具体介绍几种报道较多的肽类药物样品制备方法。PE SPE可以达到初步的去除杂质、脱盐及浓缩被分析物的目的。药动学定量分析的特点要求在尽量短的时间内准确分析尽可能多的样品。所以，该类研究的生物样品制备总体趋势是尽可能采用高通量的自动化或半自动化处理手段进行。但是，肽类药物的结构、组成、性质与生物基质含有的大量蛋白质和多肽相似甚至相同，故其样品制备过程较合成的小分子药物有所不同，通常要求方法具有更高的灵敏度和选择性。肽类样品制备方法区别于传统的小分子合成药物，因为被分析物无论是组成和结构，还是理化性质均与生物样品的基质蛋白质或多肽相同，这为该类药物的提取、分离和鉴定分析工作带来了极大的挑战。

   目前文献报道的各类技术中，根据操作方式的不同，生物样品制备方法可分为离线模式(offline mode)和在线模式(online mode)两种；根据方法原理不同，可大致分为特异性和非特异性方法两大类。前者主要指亲和层析法(affinity chromatography，AC)；后者包括蛋白沉质淀法(protein precipita—tion)、固相萃取法(solid phase extraction，SPE)、超滤法(ultrafiltration)、灌注色谱法(perfusion chro．matography，PC)、阻定性进入介质(restricted accessmedia，RAM)的应用等。多肽是生物体内重要的生命物质之一，随着肽合成技术和以噬菌体展示技术为代表的肽库技术的推广，大量候选多肽药物应运而生。这些平时并不引起我们注意的隐患也许会给我们自身健康，或者环境带来长远的影响，因此生物通网站联合《遗传》、《中国生物工程杂志》、《生命世界》杂志开展2007赛默飞世尔中国生物实验室安全现状调查活动，提出警示，珍惜生命！此次活动的现状调查报告将发于相关部门，提出宝贵意见的读者将有机会获得精美礼品。灌注色谱是近年出现的一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。制成的固相萃取柱或液相柱，可以每分钟几十毫升的高速上样，尤其在生物样品和培养基中蛋白质和肽类的分离、富集和除盐，具有独特优势。 Choi等改良了传统的多步灌注色谱法(multistep perfusion chromatography，MSPC)，开发出一步灌注色谱法(single — step perfusion chromatography．SSPC)，并成功用于大鼠肝脏组织等复杂组分的蛋白质组研究中，获得了增强的多肽信号。阻定性进入介质有两层不同的表面，外层表面通过体积排除作用提供选择性，并仅允许相对分子质量较小的分子进入内表面。内层表面通过传统的分配作用捕获分析物引。选择适当填料，实验台有望在肽类药物研究中应用。但是，上述两种方法尚未查到在复杂生物样品中蛋白质、多肽的药动学研究的报道。临床观察内容试验工作在一期临床观察室中进行，受试者由临床医生监护，受试期间发生任何不良反应均及时处理和记录。方法的专属性：在上述色谱条件下，米氮平和地西泮峰形良好，米氮平和地西泮的保留时间分别为3．1 min和2．8 min(图1)，血浆中杂质不干扰样品测定。实验方法药代动力学和生物等效性研究受试者选择20名健康男性志愿受试者，年龄为19—25岁，体重5O一75 kg，身高164—189cm。常规体检及生化检验结果证明：血、尿常规、肝、肾功能、心电图均无异常，乙肝表面抗原检查为阴性(表6)。受试前2周及试验期间停止服用任何药物，试验期间忌烟、酒，统一饮食。受试前对试验目的与要求完全了解，并由志愿者签署知情同意书。试验经南京军区总医院国家药品临床研究基地伦理道德委员会同意后进行。实验台质谱检测参数离子极性：正离子；离子化方式：电喷雾离子化；检测方式：选择性离子检测(SIM)，米氮平：m／z266．5[M+H] ，地西泮：m／z285．5[M+H] ；传输电压：50 V；干燥气流速：300L·h～；裂解气温度：350℃ ；毛细管电压：3．56 kV。试验方案采用双周期两制剂交叉试验设计。 20名男性健康受试者随机分为A、B两组，第一周期分别口服受试制剂和参比制剂，试验结束后，间隔14天清洗期，再相互交叉进行第二周期试验。

  受试者于试验前两周和试验期间均不饮用酒类和咖啡类饮料，试验前禁食过夜约12 h，次日晨(7：o0)空腹服用试验制剂(30 ms／2片)或参比制剂(3Oms／片)，200 mL温开水送服。受试者于服药后4 h进统一餐。受试者于服药前及服药后0，0．5，1．0，1．5，2．0，2．5，3，4，6，10，24，48，72，96和120 h，分别采血4．0 mL于肝素抗凝试管中，3500 r/min 离心15 min，分离出血浆，一3O℃冷冻保存、待测。样品制备血浆样品的处理：经试验，确定血浆样品处理过程如下：血样置试管(肝素化处理)中，立即于一3O℃冷冻保存。测定时，精密吸取血浆0．5 mL置于10 mL具塞离心管中，精密加入内标标准溶液15 L，混合均匀后，加入0．5 mol/L NaOH溶液100 L，漩涡10 S，加环己烷3．0 mL，涡旋提取3min，台式离心机4000 r/min 离心10 min，分取环己烷层2．5 mL，45℃水浴中氮气吹干。残留物以150 L流动相溶解，高速离心10 rain后，取上清液20 L HPLC—MS分析，测定m／z 266．5(米氮平，[M+H] )，m／z285．5(地西泮，[M+H] )的峰面积。标准溶液的配制：精密称取米氮平对照品适量，甲醇溶解，制得浓度为100/mL 的贮备液，阴凉处保存。临用前以流动相稀释成各种浓度的米氮平对照品溶液。实验台精密称取地西泮对照品适量，甲醇溶解并稀释定容，制得浓度为100μg/mL 的贮备液，阴凉处保存。临用前以流动相稀释，制成浓度约1μg/mL 地西泮标准溶液。实验方法仪器：HPLC—MS联用系统：Waters Alliance2690一Micro Quattro Micro MSD联用系统：含四元高压泵、在线真空脱气机、恒温自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口。Masslynx V3．5数据处理系统。米氮平是一种新型抗抑郁药，通过拮抗中枢自身及异体的肾上腺素 受体，增加去甲肾上腺素及5一羟色胺的释放而产生抗抑郁作用，具有较好的耐受性，且几乎无抗胆碱作用，治疗剂量对心血管系统亦无影响。文献报道的人血浆中米氮平的测定有高效液相色谱一荧光检测法 、高效液相色谱一紫外检测法 。这些方法或需特殊的色谱固定相或血浆样品处理采用毒性较大的甲苯为提取溶剂，灵敏度低、分析时间长。高效液相色谱一离子阱检测法虽具有较高的分析灵敏度，但采用SRM检测方式和特殊的色谱柱，色谱峰形的对称差，血浆样品的处理过程烦琐。考虑到临床生物样本量大、稳定性差、浓度低、专属性要求高的特点，本文经试验，首次建立了经简单液一液相萃取后，测定人血浆中米氮平的HPLC— MS分离、分析方法，检测方式：SIM。 对该方法的评价结果显示：方法的回收率高，分析时间短(3．5min／样)，最低检测浓度可达0．1 ng/mL，适用于米氮平药物的临床监控、药代动力学和生物利用度、生物等效性研究。此外，为了适应高通量、自动化处理的要求，集成了多种分离、提取、分析模式的在线处理系统也不断的研制开发并用于复杂生物样品的研究中。在线处理系统包含了诸多符合大规模样品制备或分离的装置，一般较离线方式复杂，且成本较高。此外，由于分析目标不同，目前还没有通用和成熟的商业化系统可供应用。使窒息：如一氧化碳与红血球结合而中毒，氰化物与血液结合而使中毒，硫化氢使呼吸器官麻庳而中毒。硫化氢的毒性不比氰化氢低，但它有味，使人警觉，立即采取措施，或离开，如吸多了，就不觉臭味，反而带甜味，十分危险。肽类药物的研究开发成为新生物技术药物研究开发的热点之一。然而，建立可靠、灵敏和准确的肽类药物体内分析方法是肽类药物II占床前和临床药动学研究的难点。样品制备技术是建立符合药动学研究要求的定量分析方法的关键。实验台现综述液质联用技术在肽类药物药动学研究中的样品制备技术方法的目的、要求、特点和分类。结合近年发表的文献具体阐述了固相萃取法、蛋白质沉淀法、超滤离心法、亲和层析法和部分其他方法的原理及其应用实例。米氮平分子结构中含多个苯环，且含有多个氮原子，故在C18柱上有较长保留，易形成拖尾峰。

  本文尝试采用甲醇一醋酸铵水溶液(0．01 tool/L )(75：25)、甲醇一水(含0．5％醋酸，0．5％ 三乙胺)(75：25)等体系为流动相，发现甲醇一醋酸铵水溶液(0．01 tool·L )(75：25)体系产生分离效果最佳。在所选的色谱条件下，地西泮因峰形对称，保留时间适宜，且血浆中无杂质干扰，而被用作分析测试的内标。讨论由于人体血浆中米氮平的浓度较低，且存在着较大的个体差异，采用HPLC—UV法测定时，有时可观察到少量杂质干扰其低浓度测定，有时则无法检测到样品。为保证临床大量、且复杂生物样本分析的专属性和准确性，鉴于HPLC—MS法灵敏度高、具有二次分离作用的优势，本文研究并建立了米氮平人血浆样本高效液相色谱／质谱联用分析方法，该方法对目标化合物及其内标同时进行选择性离子检测(m／z266．5及m／z285．5)，空白血浆无杂质干扰，最低检测浓度可达0．1 ng·mL～，完全满足临床血药浓度监测的要求。在电喷雾离子化状态下，用扫描方式测定米氮平的质谱，结果表明：[M+H] 离子(m／z 266．5)的响应明显高于碎片离子，因此m／z 266．5离子被选择作为米氮平的检测离子。同样的测定还表明：[M+H] 离子(m／z 285．5)为地西泮检测离子最佳离子。进一步优化质谱条件，分别在传输电压30，40，50，60 V，干燥气流速200，300，350，400 L/h，裂解气温度250，300，320，350℃条件下考察米氮平[M+H] 离子(m／z 266．5)的响应，结果表明：传输电压50 V、干燥气流速300 L/h、裂解气温度350℃的条件下，米氮平准分子离子响应最大。蛋白质沉淀法是一种快速的杂质蛋白质去除方法。受到日益激增的样品数量的影响，目前的样品制备技术正向着自动化、高通量和专属性强的方向发展。而选择适当的方法仍然要考虑很多因素，包括样品用量，提取方法的灵敏度、精密度、回收率、线性范围和最低检测限，合适的内标物等。越来越多的LC-MS方法被开发用于多肽类药物的生物样品分析，但由于样品分析通量和灵敏度有限，现阶段多肽类药物的临床前和临床评价仍然采用免疫学方法为主。目前小分子合成药物的评价大多采用质谱联用的分析方法，肽类药物乃至蛋白质类药物要达到这个目标尚需要包括样品制备、稳定同位素标记技术、质谱装置和专业分析软件等多方面技术的共同进步]。虽然，至今报道的使用LC-MS方法定量分析蛋白多肽类药物的最大相对分子质量也仅为10 464，且灵敏度有限，但LC-MS对药物原形分子的准确和精密的识别和定量分析是其他定量、定性技术难以比拟的。相信在不久的将来，随着分离技术和质谱检测技术的发展，实验台基于LC-MS的快速、稳定、可靠、准确的分析方法能够广泛的应用于生物技术药物的药动学研究中。凡有害或有刺激性气体发生的实验应在通风柜内进行，加强个人防护，不得把头部伸进通风柜内。凡是具有毒性、腐蚀性、强氧化性、强还原性、自燃性、恶臭的物质及其溶液，以及易爆、易燃物质均为化学危险品。如在实验中经常接触和使用的碱金属、金属氢化物、有机金属化合物、毒性气体、氰化物、酰卤、重氮化合物、硝基化合物、N-亚硝胺、过氧化物、毒性有机膦化物、氯磺酸、发烟硫酸、汞、重金属盐皆属危险品之列。 这些危险品一旦成为实验后的废物，必须及时妥善处理或销毁，以免造成意外事故。常用的蛋白质沉淀剂包括乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等有机溶剂，高氯酸、三氯醋酸等有机酸，饱和硫酸铵等盐类物质。某些侵入人体的少量物质引起局部刺激或整个机体功能障碍的任何疾病都称为中毒，这类物质称为毒物。根据毒物侵入的途径，中毒分为摄入中毒、呼吸中毒和接触中毒。接触中毒和腐蚀性中毒有一定区别，接触中毒是通过皮肤进入皮下组织，不一定立即引起表面的灼伤，腐蚀性中毒是使接触它的那一部分组织立即受到伤害。化学药品大致分为二类，一类是具有刺激性腐蚀性药物，一类是有毒化学药品。生物实验中发生的一些化学反应十分激烈，因此在整个实验过程中潜伏着发生各种意外的因素，实验人员在思想上要重视，需具备必要的实验中化学试剂安全知识。选择适当相对分子质量截留的超滤管(1 000～3 000)，可以有效的实现肽类物质富集浓缩和脱盐。但在使用时需注意到药物与生物样品基质的相互作用而降低回收效率。Fierens等直接将尿样进行超滤处理，结合LC-MS成功的分析了尿中C-peptide的含量。作为样品制备方法的亲和萃取(affinityextraction)是基于固相化亲和介质与其对应的目标分子特定结构域较强的特异性相互作用，分离复杂生物基质中特定组分的方法。亲和提取法是目前富集效率和专属性最高的样品提取、富集手段之一。但目前用于肽类药物定量分析研究的文献较少，这主要是由于免疫亲和层析和受体亲和层析等方法的建立造价较高，选择适当亲和力的抗体或配基较难以及反应条件的通用性较差等。Kobayashi等首次报道了利用免疫亲和层析技术提取人降钙素(human calcitonin，hCT)的制备方法，实验台并用于生物样品中hCT 的提取定量分析。

  Ander—son等 J建立了利用稳定同位素作为内标物，利用抗特定肽段的抗体亲和层析将肽段从复杂的生物体系中提取出来的方法，称作SISCAPA(stable isotope standards and capture by anti．peptide antibodies)同时将此方法成功用于复杂样品中指定蛋白质、多肽的定量分析中。 通常在沉淀蛋白质后离心，上清层可经挥干、重溶或不作处理直接进样LC．MS分离分析。具有操作简单，无需特殊装置等优势。然而，该方法由于沉淀剂的引入，同时产生了对色谱分离和质谱检测步骤的不利因素。首先，由于非特异性的沉淀反应可能使微量的分析物随着基质蛋白质共同沉淀而损失。其次，有机溶剂的引入可能影响后续的液相色谱分离效能，而有机酸和盐类物质则在喷雾电离过程中抑制分析物的离子化效率，大大降低检测灵敏度， Sibylle在利用乙腈沉淀血清蛋白质后发现多肽药物随着沉淀反应而有所损失；Yamaguchi等_在多肽KW-5139的定量研究中使用乙腈沉淀蛋白质后，上清层直接进样分析获得了满意的结果，同时讨论了不同pH值下分析物的多电荷离子分布情况。目前，国内外已有上百种多肽类药物进入临床前评价、临床试验或应用阶段。然而建立可靠、灵敏和准确的肽类药物体内分析方法是肽类药物临床前和临床研究评价的难点和关键。该类研究主要采用同位素标记结合色谱分离法、免疫测定法和生物检定法_，但上述各方法在精确区分和指认药物原形和代谢物等结构相关信息方面体现了一定的局限性。对此，国内外均做了相对全面的比较和综述。在过去的十多年中，随着基质辅助激光解吸附电离和电喷雾电离接口技术的飞速发展，生物质谱与多种高效的分离手段特别是高效液相色谱的联用(LC-MS)技术成为复杂组分中生物大分子定性、定量分析的有力工具_5 J。近年国外已有部分液质联用技术应用于肽类药物定量分析的研究论文发表。John等总结建立复杂生物样品的肽类物质分析方法中，各类研究的焦点主要集中在样品制备技术、内标物选择和质谱装置与检测模式的选择这2个方面。最近，Ji等首次提出了基于LC-MS定量分析生物样品中相对分子质量较低的蛋白质、多肽药物的策略，并指出阻碍该策略广泛应用于体内蛋白质定量分析的瓶颈主要是生物样品制备技术的问题。回收率试验对照样品：取离心管数支，不加血浆，精密加人不同量的米氮平对照品溶液，使其浓度分别为2．0，20，80 ng/mL，并加人1 /mL 的内标溶液15L，混合后将溶剂挥干，残渣用150μL流动相涡旋溶解，20μl 进人HPLC—MS分析。记录色谱图，并计算米氮平峰面积与内标峰面积的比值。回收率样品：于离心管中加人0．5 mL空白血浆，精密加人不同量的米氮平对照品溶液，使其浓度分别为2．0，20，80 ng/mL，混合均匀后，加人0．5mol/L NaOH溶液100μL，漩涡10 s，加环己烷3．0 mL，涡旋提取3 min，于4000 r/min 离心10min，取上清液2 mL转移至另一离心管中，加人1μg·mL 的内标溶液15 L，混合后在40℃水浴上用氮气流吹干，残渣用150 流动相涡旋溶解，20μl进入HPLC—MS分析。计算米氮平峰面积与内标峰面积的比值。线性关系及灵敏度：取离心管数支，于0．5 mL空白血浆中精密加入不同量的米氮平标准溶液，配成浓度为0．2，0．6，2．0，10．0，20．0，40．0，80．0，120．0 ng/mL 的标准血浆，按“血浆样品的处理”项下操作，记录峰面积。以样品面积与内标面积(A／s)的比值对浓度(C)作直线回归。得回归方程：f=0．0176 C+0．0006 r t>0．9992显然，在0．2—120．0 ng/mL 范围内，质谱响应值和浓度线性关系良好。米氮平在血浆中的最低检测浓度为0．1 ng/mL。 精密度试验：取离心管数支，精密加人0．5mL空白血浆后，再精密加人不同量的米氮平对照品溶液，配成浓度为2．0，20，80 ng/mL 的含药血浆，实验台按“血浆样品的处理”项下操作，记录样品面积与内标面积(A／s)的比值。测定日内精密度和5天内的日间精密度。药代动力学研究 ：受试制剂和参比制剂给药后的血药浓度一时间曲线见图2，按“1．6”部分内容估算的主要药代动力学参数见表3。供试片的相对生物利用度为(101．3±16．2)％ 。